研究成果のポイント
・細菌多剤耐性化に深く関与していることが知られているRND型薬剤排出ポンプ数百種類について、 分子系統解析を行うことにより、これらポンプの遺伝的進化を初めて解明した。
・細菌には複数の抗菌薬を排出することのできる多剤排出ポンプが存在しているが、これらポンプの多剤排出能（複数の抗菌薬を排出する能力）は、古くから備わっているものであるのか、進化的に獲得されたものであるのかについては謎であった。
・本研究によって、病原細菌であるインフルエンザ菌に存在する RND 型薬剤排出ポンプによって多剤耐性化が引き起こされる潜在的リスクが明らかになった。インフルエンザ菌の潜在的な多剤耐性因子や薬剤排出ポンプの進化を理解することは、新規抗菌薬の開発にとって重要である。
※インフルエンザ菌はインフルエンザウイルスとは異なる病原体です。
概要
大阪大学産業科学研究所のMartijn Zwama（マータイン ズワーマー）特任助教（常勤）、西野邦彦教授らの研究グループは、細菌の多剤耐性（※1）化に関与するRND型多剤排出ポンプ（※2）の進化的解析（※3）を行い、インフルエンザ菌（※4）がなぜβ-ラクタム系抗菌薬（※5）に感受性を示すのかを明らかにしました。また、インフルエンザ菌に存在する薬剤排出ポンプ（※6）には、本菌の感染症治療に用いられるβ-ラクタム系抗菌薬を含め、幅広い薬剤を排出する能力が備わっていることを証明し、これが本菌における潜在的なリスクであることも明らかにしました。
さらに西野教授らの研究グループは、複数の細菌に存在する、数百個ものRND型薬剤排出ポンプを解析することで、初めてこれらポンプ間の系統発生に関する知見を得ることに成功しました。
インフルエンザ菌の多剤排出ポンプAcrB（AcrB-Hi）が、進化上、比較的古い排出ポンプであることを明らかにし、新しいポンプである大腸菌AcrB（AcrB-Ec）との機能を比較して解析を行いました。
近年、多剤排出ポンプによって引き起こされる多剤耐性菌を克服するために、様々な阻害剤（※7）が開発されていますが、本研究成果から考えられることは、これら阻害剤が、例えば、進化的に古いインフルエンザ菌のポンプに効力を示さない等、全てのRND型の多剤排出ポンプを阻害できない可能性があることです。
本研究では、排出ポンプAcrBに加えて、外膜タンパク質（※8）OmpP2との組み合わせで、インフルエンザ菌のβ-ラクタム系抗菌薬感受性が決定されていることを分子的に説明しており、本成果は、新たな知見を提供するものです。
数百種類にもおよぶ排出ポンプの系統解析は、これまでに研究されていなかった他の細菌や生物に存在する排出ポンプの機能と分類を予測するのにも役立つと考えられます。細菌における抗菌薬の薬物動態（※9）および、進化を含む多剤排出ポンプによる分子防御機構に関する知識は、新規抗菌薬の開発と多剤耐性細菌を克服するために重要なものです。
本研究成果は、英国科学誌「Communications Biology」に、9月13日（金）午後6時（日本時間）に公開されました。
研究の背景
インフルエンザ菌b型（Hib）は、臨床的に問題となっている病原細菌であり、今日、抗菌薬に耐性を示す細菌の出現が、世界中で、人の健康の脅威となっています。細菌多剤耐性化機構の１つとして、RND型排出ポンプの存在があり、このポンプは、多くの構造的に関連性のない抗菌薬や毒物を排出します。
西野教授らの研究グループは、インフルエンザ菌の多剤排出ポンプAcrB（AcrB-Hi）が、進化上、比較的古い排出ポンプであることを明らかにし、新しいポンプである大腸菌AcrB（AcrB-Ec）との機能を比較して解析を行いました（図１）。AcrB-Hiは、AcrB-Ecから系統的に離れているにもかかわらず、Hib感染症治療に用いられるβ-ラクタム系抗菌薬を含め、AcrB-Ecと同様に幅広い薬剤を排出する能力が備わっていることを実験的に証明しました。すなわち、RND型ポンプにみられる多剤排出能は進化的に獲得されたものではない可能性があり、古来、この能力が備わっていたことが示唆されます。
進化したAcrB-Ecには、薬物結合ポケットにアミノ酸であるフェニルアラニンに富んだ疎水性トラップがあり、これはAcrB-Hiにはない特徴です（図2）。西野教授らは、排出ポンプ阻害剤であるABI-PPがこのトラップに強く結合して、フェニルアラニン残基と強く結合することを以前に発見しましたが (Nature 1;500 (7460), 2013) 、本研究で、AcrB-Hiは阻害剤によって機能が抑制されないことが分かりました。また、AcrB-Ecは抗菌薬排出に加え、非常に効率的に胆汁酸塩も排出しますが、AcrB-Hiの胆汁酸排出能力はとても低いものであり、このことから、大腸菌が生息する胆汁酸塩が富んだ環境に適合するためにポンプも適応したことが示唆されます。
次に、AcrB-Hiが多くのβ-ラクタム系抗菌薬を効率的に排出するにも関わらず、なぜ、インフルエンザ菌がβ-ラクタム系抗菌薬に感受性を示し、本薬による治療が効果的であるのか、その理由を明らかにしたいと考えました。その結果、口径が広い外膜タンパク質OmpP2がインフルエンザ菌に存在することが、その理由であることが分かりました。OmpP2が存在することにより、β-ラクタム系抗菌薬はより効率的にインフルエンザ菌の中に流入し、この効率的な流入がAcrB-Hiポンプによる能動的排出を相殺していることが分かりました。
本研究における実験結果から、RND型排出ポンプによる多剤排出能は古来備わっているものであることが考えられます。AcrB-Ecは進化して、ピット（※10）がよりフェニルアラニンが富んだ状態になり、より効率的で特異的なポンプとなったと考えられますが、その結果、阻害剤によって機能が抑制されることになったことは、細菌にとって不利な予期せぬ進化の結果であったことが示唆されます。将来的にAcrB-Hiポンプが過剰発現し、外膜タンパク質OmpP2の変異や発現の低下により、現在β-ラクタム系抗菌薬に感受性であるインフルエンザ菌Hib株が多剤耐性化して臨床的に問題になる可能性があります。
図1
RND型多剤排出ポンプの系統樹。クラスター毎に青色で表示しており、その中に存在するサブクラスターは濃い青色で示す。インフルエンザ菌AcrBポンプ（AcrB-Hi）は左側に存在しており、大腸菌AcrB（AcrB-Ec）は右に位置している。
図2
進化したAcrB-Ec（大腸菌ポンプ）に存在するフェニルアラニン残基に富んだ領域と系統的に古いAcrB-Hi（インフルエンザ菌ポンプ）との比較. AcrB-Ecにはこの領域にフェニルアラニンが6個存在しているのに対して、AcrB-Hiには1個しか見当たらない。
本研究成果が社会に与える影響（本研究成果の意義）
本研究によって、病原細菌であるインフルエンザ菌に存在するRND型薬剤排出ポンプによって多剤耐性化が引き起こされる潜在的リスクが明らかになりました。本病原細菌は、特に乳幼児に対して、髄膜炎や肺炎など重篤な症状を引き起こすことがあり、世界的に問題となっています。インフルエンザ菌の潜在的な多剤耐性因子や薬剤排出ポンプの進化を理解することは、新規抗菌薬の開発にとって重要なものです。
図3
大腸菌とインフルエンザ菌における薬剤排出ポンプとポリン（外膜タンパク質）の相互作用。AcrBポンプは、ペリプラズムと細胞質から抗菌薬を能動的に排出し、細胞内の抗菌薬濃度を低下させることで、それらの菌に対する効力を弱めることができる。大腸菌ポンプAcrB-Ecは、大腸菌の生育環境である腸内に存在する物質である胆汁酸塩を排出することができるが、インフルエンザ菌ポンプAcrB-Hiは胆汁酸塩をほとんど排出できない。排出ポンプ阻害剤ABI-PPはAcrB-Hiを阻害できないが、AcrB-Ecの排出能力を完全に阻害する。インフルエンザ菌に存在する口径が広い外膜タンパク質OmpP2は、β-ラクタムやノボビオシン等の小さい抗菌薬を細胞内に流入させ、インフルエンザ菌はこれらの抗菌薬に感受性を示す。
特記事項
本研究成果は、9月13日（金）午後6時（日本時間）に英国科学誌「Communications Biology」（オンライン）に掲載されました。
タイトル："Phylogenetic and functional characterisation of the Haemophilus influenzae multidrug efflux pump AcrB"
著者名：Martijn Zwama, Akihito Yamaguchi and Kunihiko Nishino
DOI：10.1038/s42003-019-0564-6
用語説明
※1 多剤耐性
多剤耐性は、作用機序が異なる複数の抗菌薬に対して細菌が耐性を示すことをいう。多剤耐性細菌による感染症は、抗菌薬治療が困難となるため、世界中で問題となっている。
※2 RND型多剤排出ポンプ
複数の抗菌薬（多剤）を細菌の中から外に排出するポンプを多剤排出ポンプと呼び、その構造とエネルギー共役の違いから大きく6つに分類することができる。RND（resistance nodulation cell-division）は、内膜タンパク質、ペリプラズムのタンパク質、外膜タンパク質の3つから構成され、マルチコンポーネント型とも呼ばれる。主にグラム陰性菌の多剤耐性化に関与することが知られている。
※3 進化的解析
インフルエンザ菌に存在する多剤排出ポンプAcrB-Hiを解析するにあたり、大腸菌の多剤排出ポンプAcrB-Ecを含め、複数の細菌に存在する数百種類もの薬剤排出ポンプの配列情報に基づき、分子系統解析を本研究では行っている。これにより、薬剤排出ポンプの進化的道筋が分かり、AcrB-Ecは系統的にAcrB-Hiから遠く離れており、最新の進化したポンプであると考えられる。
※4 インフルエンザ菌
主に中耳や呼吸器に感染する細菌であり、非莢膜型と莢膜（細菌の外側に存在する粘質状構造物）型に分類される。中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎等が感染症として知られている。莢膜型の中でも、b型の莢膜を有するインフルエンザ菌b型（Hib）は、乳幼児に敗血症や髄膜炎等の重篤な侵襲性感染症を引き起こすことがあるため、ワクチンの定期接種が行われている。インフルエンザ患者から同定された歴史的経緯から、インフルエンザ菌の名前が付いているが、インフルエンザの病原体であるウイルスとは異なる。
※5 β-ラクタム系抗菌薬
抗菌薬の中で、β-ラクタム構造をもつものを指す。細菌に特有である細胞壁合成酵素を特異的に阻害するために、ヒトに対する毒性が低く、臨床的にもよく用いられる抗菌薬である。
※6 薬剤排出ポンプ
抗菌薬を細菌の中から外に排出するポンプであり、細菌の抗菌薬に対する自然耐性と獲得耐性の両方に関係する。抗菌薬のターゲットの多くは、細菌の中に存在しているが、薬剤排出ポンプは、菌の中の抗菌薬濃度を低下させ、薬剤耐性の原因となる。
※7 阻害剤
タンパク質に結合して、タンパク質が持っている活性を低下させる物質を示す。薬剤排出ポンプの阻害剤は、薬剤排出能力を低下させ、既存の抗菌薬を有効活用することができるため、多くの研究室や企業が開発に着手している。
※8 外膜タンパク質
グラム陰性菌は、細胞質膜（内膜）の外側に細胞壁が存在し、さらにその外側に外膜がある。その外膜に存在するタンパク質の総称が、外膜タンパク質である。外膜タンパク質であるポリンは、大きな孔を持つため、分子の受動的拡散が起こる。一般的に糖、アミノ酸、イオンの小さな物質の拡散に関与しているが、一部の抗菌薬の透過にも関係する。
※9 薬物動態
一般的には生体に投与された薬物が排泄されるまでの過程のことであるが、ここでは、細菌に対して抗菌薬が流入して排出されるまでの過程を示している。多くの抗菌薬のターゲットは、細菌体内に存在するため、その効力は、菌体内の抗菌薬濃度によって決まる。本研究では、抗菌薬の流入速度に影響する外膜タンパク質と、排出に影響する多剤排出ポンプの両方について解析を行っている。
※10 ピット
本研究では、薬剤排出ポンプ内に存在する阻害剤が結合する領域を示している。フェニルアラニンが多く存在する疎水的環境が、構造上、阻害剤が結合できる窪み（ピット）のように見える。